دانلود پایان نامه

4-4-3-بررسی خواص بازدارندگی باکتری‌های آنتاگونیست در گلخانه علیه قارچ بیمارگر:
در آزمایشات گلخانه‌ای بمیزان 200 گرم خاک به گلدان (لیوان یکبار مصرف) اضافه شد و همزمان 3 گرم اینوکلوم آماده بیمارگر (بذر ارزن) به هر کیلو خاک گلدان اضافه گردید. تیمارها شامل: شاهد سالم، شاهد آلوده (فقط بیمارگر) و 30 جدایه برتر (سوسپانسیون 109 باکتری در میلی‌لیتر با اضافه اینوکلوم قارچ بیمارگر) است.
گلدان‌ها در گلخانه در دمای 27 درجه سانتی‌گراد در روز و 20 درجه درشب قرار گرفتند و یک روز در میان بمدت یک هفته آبیاری شدند. پس از آن به محض خشک شدن سطح خاک، آبیاری صورت گرفت.
میزان وزن تر و خشک ریشه و اندام هوایی پس از 35 روز بررسی شد.
شدت بیماری براساس مقیاس صفر تا پنج کیم و همکاران (1997) صورت گرفت.
0= گیاه سالم
1= کمتر از 20 درصد ریشه آلوده و دارای حداقل یک شانکر قهوه ای درشت .
2= حدود 50 درصد ریشه دارای شانکر تیپیک
3= حدود 70 درصد ریشه دارای شانکر تیپیک
4= مرگ گیاهچه پس از بیرون آمدن از خاک و طول گیاهچه کمتر از5 سانتی‌متر
5= مرگ گیاهچه قبل از بیرون آمدن از خاک و یا پوسیدگی بذر
درصد شدت بیماری بر اساس فرمول زیر محاسبه گردید:
DI=
ni= مقیاس آلودگی
m= تعداد گیاهچه‌های تکرار
5-3- قدرت کلونیزاسیون
1-5-3- بررسی میزان کلونیزاسیون بذر لوبیا توسط استرینVUP50 و CHA0 :
از روش گلاندورف و همکاران (1992) استفاده شد. یک گرم از بذر لوبیا آغشته به 109 سلول باکتری در میلی‌لیتر این دو استرین در 100 میلی‌لیتر آب مقطر استریل به مدت یک ساعت در 150 دور در دقیقه روی دستگاه شیکر در ارلن 250 میلی‌لیتر غوطه‌ور شد. سپس یک میلی‌لیتر از سوسپانسیون حاصل را برداشته وسری رقت تهیه گردید. سپس 100 میکرو‌لیتر از رقت مورد نظر روی محیط کینگ ‌بی پخش گردید و پس از 48 ساعت جمعیت شمارش شد.
2-5-3- بررسی قدرت کلونیزاسیون ریشه دو استرین VUP50 و CHA0در حضور بیمارگر:
از روش یان و همکاران (2003) استفاده شد. دو جدایه باکتری با جمعیت 109سلول باکتری در گرم به بذور لوبیا تلقیح گردید و در گلدان حاوی خاک استریل کشت شد. پس از چهار هفته ابتدا ریشه‌ها توسط جریان ملایم آب شسته شدند و سپس آبگیری شدند. یگ گرم از ریشه در ارلن 250 میلی‌لیتر حاوی100 میلی‌لیتر آب مقطر استریل ریخته و به مدت یک ساعت بر روی شیکر دورانی با سرعت 150 دور در در دقیقه قرار گرفت. سریال رقت تهیه و 100 میکرو‌لیتر از رقت مورد نظر روی محیط انتخابی S1(3 /2 گرم فسفات‌پتاسیم،10 میلی‌لیتر گلیسرول، 2/1 گرم سدیم‌لوریل‌سارکوزین، 5 گرم اسید کاسامینو، 20 میلی‌‌گرم تری‌متو‌پریم،1گرم کربنات‌سدیم، 18 گرم آگار، 1 گرم سولفات‌منیزیوم و یک لیتر آب مقطر استریل) ریخته شد. پس از نگهداری بمدت 24 ساعت در دمای 25 درجه سانتی‌گراد شمارش باکتری صورت گرفت. این آزمایش در قالب طرح تصادفی شامل 2 تیمار و 3 تکرار انجام شد.
6-3- تولید ترکیبات ضد قارچی
1-6-3- بررسی تولید آنتی‌بیوتیک :
این آزمون بر اساس روش کرایوس و لوپر (1990) انجام گرفت. با اپندورف 100 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری و آب مقطر سترون (شاهد) به محیط PDA اضافه و پخش شد و بمدت سه روز در دمای 25 درجه سانتی‌گراد نگه‎داری شد. پس از این مدت با استفاده از میله شیشه‌ایی و آب مقطر سترون، کلنی‌ها شسته شدند. سپس پنبه سترون آغشته به کلروفرم درون پتری قرار گرفت. پس از 30 دقیقه تمام باکتری‎ها از بین رفتند. سپس یک حلقه به قطر نیم سانتی‌متر از حاشیه کشت چهار روزه قارچ با رعایت شرایط استریل در وسط محیط کشت پتری قرار گرفت. پتری در دمای 25 درجه قرار گرفت.
2-6-3- تولید ترکیبات فرار ضد قارچی:
این آزمون مطابق روش کرایوس و لوپر انجام گرفت. در مرحله اول آزمایش 200 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری توسط میله شیشه‌ایی بر سطح محیط PDA پخش شد و پتری‌‌ها بمدت سه روز در دمای 25 درجه سانتی‌گراد نگه‌داری شدند. در مرحله دوم، حلقه‌ایی به قطر نیم سانتی‌متر از حاشیه کشت چهار روزه قارچ در مرکز پتری حاوی PDA کشت گردید. سپس با رعایت شرایط استریل پتری حاوی قارچ به طور وارونه روی پتری حاوی باکتری قرار گرفت و لبه پتری‌ها توسط نوار پارافیلم مسدود گردید و سپس در دمای 25 درجه سانتی‌گراد گذاشته شد. در پتری شاهد فقط حلقه‌ایی از محیط PDA حاوی قارچ در مقابل پتری حاوی PDA بدون باکتری قرار گرفت. این دو آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی در سه تکرار انجام گرفت و اندازه‌گیری رشد میسلیوم پس از 7-3 روز انجام گرفت.