دانلود پایان نامه
نمونه‌برداری از میزبان های گیاهی مختلف از سه منطقه متفاوت آب و هوایی ایران بمدت 4 ماه صورت گرفت که شامل منطقه پرباران شامل شهرهای: گرگان، اردبیل، رشت، انزلی و منطقه متوسط باران شامل شهرهای: اصفهان، شیراز، کرمان، بافت و جیرفت و منطقه کم باران شامل شهرهای، شهداد، بم، بندرعباس، رفسنجان و یزد می‌باشد (جدول 1).
برای جدا سازی باکتریهای آنتاگونیست از روش ساراوانان و همکاران (2004) استفاده شد. خاک اطراف ریشه و طوقه میزبانهای گیاهی مختلف پس از جمع‌آوری از عمق حدود20-15 سانتی‌متری به آزمایشگاه منتقل شد. یک گرم از خاک هر نمونه به صورت جداگانه به داخل لوله آزمایش حاوی 10 میلی‌لیتر آب مقطر سترون ریخته شد. رقت‌های مختلف بصورت سریال در 9 میلی‌لیترآب مقطر سترون تهیه شد و از رقت های 6 و 7 به مقدار 100 میکرولیتر روی محیط آگار مغذی (Nutrient Agar) ریخته و به وسیله میله شیشه‌ای L شکل پخش شد. پس از 48 ساعت نگهداری در دمای 30-25 درجه سانتی‌گراد، کلنی‌های تولید شده از لحاظ رنگ و شکل و اندازه متفاوت انتخاب و برای انجام آزمایشات بعدی خالص سازی شدند.
1-2-3- نگهداری باکتری:
برای نگهداری باکتری های جدا شده از سه روش استفاده شد:
الف ) نگهداری زیر پارافین: براساس روش کیم و همکاران (1997) باکتری‌ها را روی محیط غذایی کینگ‌بی ((KB داخل لوله آزمایش بصورت مورب (Slant) کشت داده و بعد از رشد کامل روی محیط، پارافین مایع دو بار سترون شده (اتوکلاو شده در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه( ریخته و در دمای 4 درجه سانتی‌گراد یخچال نگهداری شد.
ب) نگهداری در آب مقطر: بر اساس روش ولروکوک (1983) ابتدا آب مقطر حاوی محلول 1/0 مولار سولفات منیزیوم تهیه و پس از استریل نمودن یک لوپ از کشت 24 ساعته باکتریایی آن منتقل شد.
ج) نگهداری در دمای 80- درجه سانتی گراد: براساس روش فرنادو و همکاران (2004) یک لوپ از کشت 24 ساعته باکتری را به ارلن حاوی محیط آبگوشت غذایی (Nutrient broth)منتقل کرده و برروی شیکر دورانی با دور 150 دور در دقیقه بمدت 24 ساعت می‌گذاریم. برای جمع‌آوری باکتری‌ها از سانتریفیوژ 6000 دور در دقیقه بمدت 5 استفاده کرده و برروی باکتری‌ها محیط کیگ‌بی مایع به همراه 30 درصد گلیسرول سترون شده ریخته و در دمای 80- درجه گذاشته شد.
2-2-3- قدرت بازدارندگی جدایه‌های باکتریایی از رشد قارچ بیمارگر درون پتری‌دیش ( (plate assay:
از روش تاریق وهمکاران (2009) استفاده شد. باکتری‌های جدا شده از ریزوسفرو خاک بهمراه باکتری‌های موجود در کلکسیون آزمایشگاه بیماری شناسی دانشگاه ولی‌عصر (عج) بصورت نقطه‌ای برروی محیط کینگ‌بی (King’B) و PDA(نسبت1:1) به فاصله 5/0 سانتی متر هر لبه پتری در 3 گوشه پتری کشت داده شد و در یکطرف پتری شاهد که فقط قطعه ای از محیط PDA بود قرار گرفت. سه روز بعد قطعه‌ای به قطر 5 میلی متر از محیط کشت 5 روزه حاوی قارچ در وسط پتری قرار گرفت . پتری‌ها بمدت 3 تا 7 روز در دمای 25 در جه سانتی‌گراد نگهداری شدند. برای مقایسه بازدارندگی فاصله کلنی باکتری تا میسیلیوم قارچ اندازه‌گیری شد. این آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد.
= درصد بازدارندگی
رشد هیف در شاهدA=
رشد هیف در تیمار B=
3-3- شناسایی جدایه‌های باکتریایی :
شناسایی خصوصیات مرفولوژیک، بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی باکتری‌ها براساس آزمون گرم، اکسیداز، تولید رنگدانه فلورسنت برروی محیط کینگ‌بی، آرژنین دی هیدرولاز، رشد در 4 و 41 درجه سانتی‌گراد، لهانیدن سیب‌زمینی و واکنش فوق حساسیت با استفاده از روش شاد و همکاران (2001) صورت گرفت.
4-3- آزمایشات گلخانه‌ای :
1-4-3- تهیه مایه تلقیح بیمارگر و اثبات بیماریزایی برروی لوبیا در شرایط آزمایشگاه :
برای تهیه مایه تلقیح بیمارگر (Rhizoctonia solani)از روش مارهوفر و همکاران (1994) استفاده شد. در این روش برای مایه تلقیح از ارزن استفاده شد. بدین ترتیب که ابتدا ارزن‌ها درون الک زیر آب شسته، سپس داخل بشر ریخته و روی آن آب ریخته شد و بمدت 2 ساعت به همان حالت نگهداری شد تا دانه‌ها بخوبی خیس بخورند سپس یک لایه ارزن (100-50 گرم) در ارلن 250 میلی لیتر ریخته و مقداری آب مقطر و پودر برگ و ریشه لوبیا به آن اضافه گردید. سپس دو بار و در دو روز متوالی بمدت 30 دقیقه در دمای 121 درجه سانتی‌گراد استریل شدند و سپس به ‌هر ارلن 5 قطعه 5 میلی‌متری از محیط کشت 5 روزه قارچ اضافه شد و بمدت 2 الی 3 هفته در دمای 27-25 درجه سانتی‌گراد نگه‌داری شد. برای رشد بهتر قارچ هر 3-2 روز یکبار ارلن‌ها تکان داده می‌شد.
برای مایه‌زنی ابتدا گلدان‌ها با مخلوط خاک رس، برگ و ماسه به نسبت حجمی 3:1:1 استریل شده با اتوکلاو پر شدند. سپس 3 گرم بذر ارزن به ازای هر کیلو خاک گلدان اضافه و مخلوط در گلدان قرار گرفت در هر گلدان 3 عدد بذر لوبیا رقم ناز (تهیه شده از موسسه اصلاح و تهیه بذر و نهال کرج ) کاشته شد.
در گلدان شاهد بذر ارزن که شامل قارچ بیمارگر بود اضافه شد. این آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی با 4 تکرار انجام شد. درصد مرگ گیاهچه پس از 35 روز براساس فرمول زیر محاسبه گردید:
100× -1= درصد گیاهچه سالم در تیمار
2-4-3– تهیه مایه تلقیح جدایه‌های آنتاگونیست :
پس از انجام تست هاله، جدایه‌های برتر از لحاظ بیشترین میزان بازدارندگی انتخاب شدند. سپس با انجام آزمایشات فیزیولوژیک و بیوشیمیایی جدایه‌های متعلق به سودوموناس‌های فلورسنت برای انجام تست گلخانه گزینش شدند.
مطابق روش گوندر و کورستن (2006)، جدایه‌ها بمدت 48 ساعت برروی محیط گینگ‌بی رشد داده شده و سپس 100 میکرولیتر سوسپانسیون باکتری تهیه و به ارلن 250 میلی‌‍لیتر حاوی محیط کینگ‌بی مایع که شاملgr) 20 پروتئازپپتون، gr Mgso4.7H2O5/1 ،gr K2HPO4 5/1، 15 میلی‌لیتر گلیسرول در یک لیتر آب مقطر منتقل شده و بمدت 24 ساعت برروی شیکر دورانی (150 دور در دقیقه و دما 25 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت) سلول های باکتریایی با استفاده از سانتریفیوژ (10000 دور در دقیقه و بمدت 10 دقیقه) از محیط مایع جدا شدند و برای برطرف شدن باقیمانده محیط غذایی، در محلول 1/0 مولار نمک‌طعام شستشو شدند سپس سلول باکتریایی با سانترفیوژ مجدد از این محلول جداسازی شد و از آن‌ها در 10 میلی‌لیترآب مقطر سترون سوسپانسیون تهیه گردید و پس از رقیق‌سازی جمعیت بررسی شد.
3-4-3- آغشته ‌سازی بذور با باکتری‌های آنتاگونیست :
بذور لوبیا رقم ناز بمدت سه دقیقه با هیپوکلریت سدیم 2 درصد ضدعفونی سطحی شده و سه بار آب مقطر استریل شسته شدند. به منظور آغشته‌سازی از روش صلاح‌الدین و همکاران (2010) استفاده شد و پس از تهیه مایه تلقیح باکتری‌ها و تعیین جمعیت، سوسپانسیون 109 (سلول در میلی‌لیتر) باکتری در محلول یک درصد کربوکسی‌متیل‌سلولز تهیه گردید. 1 گرم بذر درون سوسپانسیون ریخته شد و بمدت نیم ساعت روی شیکر 70 دور بر دقیقه قرار گرفت.