منابع مقاله درمورد پایداری و نگهداری

دانلود پایان نامه

3-3 سنتز شیمیایی DNA ناحیه C2 پروتئین ALCAM
3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب
توالی طراحی شده ناحیه C2 پروتئین ALCAM توسط شرکت Biomatik کانادا بصورت شیمیایی سنتز شد و درون وکتور pBSK قرار داده شد.
3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده
DNA لیوفیلیزه شده را می توان توسط بافر TE استریل یا آب بدون نوکلئاز در PH طبیعی و با توجه به امکانات محیط آزمایشگاه بصورت محلول در آورد. و سپس می توان آن را در دمای بین20- تا 80- درجه سانتیگراد برای مدت طولانی نگهداری کرد. DNA لیوفیلیزه شده، محلول شده به کمک بافر TE می تواند به مدت 6 ماه در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شود در صورتی که اگر از آب برای محلول سازی استفاده شود امکان نگهداری در 4 درجه سانتیگراد وجود ندارد.
3-3-3 محلول سازی DNA لیوفیلیزه
قبل از باز کردن تیوب حاوی DNA ، ابتدا بهتر است به مدت چند ثانیه تیوب را سانتریفیوژ کنیم تا DNA های متصل به دیواره جدا شوند. در صورت عدم سانتریفیوژ ممکن است مقداری از ذخیرهی DNA در هنگام برداشتن آن به دیواره های سر سمپلر بچسبد و از دسترس خارج شود.
1.استوک اصلی: µg 10 از DNA لیوفیلیزه در µl 100 از بافر TE حل شد.
2. استوک مورد استفاده: در یک میکروتیوب دیگرµl 1 از استوک اصلی در µl10 از بافر TE حل شد. ( غلظت نهایی به ng/ µl10 رسید.)
3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP+ pBSK حاوی DNA ناحیهC2پروتئین ALCAM
3-4-1 آماده سازی باکتری شایسته
جهت آماده سازی باکتری Top 10 برای پذیرش پلاسمید ابتدا باید آن را کامپتنت یا شایسته سازی کرد.
3-4-1-1 مواد و محلول ها
– محلول کلرید کلسیم 0.1 مولار
– LB براث بدون آنتی بیوتیک
– LB براث حاوی آمپی سیلین ( پس از ساختن براث و سپس سرد شدن آن بعد از اتوکلاو کردن، آمپی سیلین به محیط کشت افزوده شد. غلظت آمپی سیلین باید حدود 100 میکروگرم در هر میلی لیتر باشد )
– LB آگار حاوی آمپی سیلین ( روش تهیه دقیقا مشابه LB براث است ).
3-4-1-2 روش کار
باکتری را در محیط کشت فاقد آمپی سیلین کشت داده.
2- برای مدت24 ساعت (over night) محیط کشت را در انکوباتور قرار داده، یک تک کلون از آن را انتخاب کرده و به 5 میلی لیتر محیط LB مایع بدون آمپی سیلین تلقیح می کنیم و سپس به مدت یک شب تا صبح در شکیرانکوباتور قرار می دهیم تا باکتری رشد کنند.
3- 400 میکرو لیتر از محیط فوق را به 5 میلی لیتر محیط LB براث تازه تلقیح نموده و مجددا آن را به مدت 2تا 3 ساعت در شیکرانکوباتور قرار می دهیم. تا محیط کدورت مناسب یعنی جذب 5/0 تا 8/0 در500 نانومتر را به ما می دهد در این حالت باکتری در فاز رشد لگاریتمی خود قرار دارد.
4- باکتری هایی که به این طریق تازه گشته و در فاز لگاریتمی تکثیر می باشند را در چند میکروتیوب استریل توزیع کرده و 5 الی 10 دقیقه روی یخ نگه می داریم.
5- میکروتیوب ها را 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم.