منابع مقاله درمورد نگهداری و سانتریفیوژ

دانلود پایان نامه

6- مایع رویی را دور ریخته و رسوب باکتری را در یک میلی لیتر محلول استریل 1/0 مولار کلرید کلسیم حل می کنیم .


7- 20 تا 30 دقیقه محلول مذکور را روی یخ انکوبه می کنیم .
8- این بار رسوب را در 600 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل 1/0 مولار حل می کنیم .
9- 20 تا 30 دقیقه محلول را روی یخ انکوبه می کنیم.
10- سپس محلول را به مدت 3 دقیقه در9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
11- رسوب را در 300 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل حل میکنیم.
12- به مدت 20 دقیقه محلول را بر روی یخ قرار می دهیم.
این باکتری ها تا 72 ساعت روی یخ در یخچال قابل نگهداری می باشند و می توان با افزودن گلیسرول استریل 30 درصد آن ها را در 70- درجه سانتیگراد به مدت چند ماه نگهداری کرد .
3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10 E.coli
بدین منظور از سویه E.coli Top10 که یکی از رایج ترین سویه های کلونینگ است استفاده می کنیم. این باکتری به تنهایی حساس به آمپی سیلین است و نمی تواند در محیط حاوی آمپی سیلین رشد نماید ولی وقتی وکتور را جذب کند نسبت به آنتی بیوتیک آمپی سیلین مقاوم شده و بر روی آگار حاوی آمپی سیلین رشد می کند .
3-4-2-1 روش کار:
1- 50 میکرولیتر سوسپانسیون سلولی شایسته را ابتدا روی یخ ذوب می کنیم.
2- 2 میکرولیتر از پلاسمید AMP+-pBSK حاوی DNA ناحیه C2پروتئینALCAM را به آن اضافه می کنیم .
3- این مخلوط را به مدت 30 دقیقه روی یخ قرار می دهیم .
4- نمونه ها را به مدت 90 ثانیه در بن ماری 42 درجه سانتیگراد قرار می دهیم و بلافاصله به روی یخ منتقل می کنیم و 5 دقیقه اجازه می دهیم بدون حرکت روی یخ بماند.
5- مخلوط فوق را به 900 میکرولیتر از محیط LB فاقد آمپی سیلین افزوده و آن را به مدت 5/1 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه قرار می دهیم تا باکتری های ترانسفورم شده بتواند شروع به تکثیر نمایند.
6- مخلوط فوق را به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
7- 700 میکرولیتر از مایع رویی را دور ریخته و رسوب را در 250 میکرولیتر باقی مانده خوب حل می کنیم.
8- 100 میکرولیتر را روی یک پلیت LB آگار و150 میکرولیتر را روی یک پلیت دیگر دارای LB آگار آمپی سیلین دار ریخته و کشت سه قسمتی می دهیم ، اجازه می دهیم کاملا جذب محیط شده و سپس آن ها را به مدت 18 تا 20 ساعت در انکوباتور 37 درجه نگهداری می کنیم .
9. 100 میکرولیتر از باکتری شایسته شده که عمل ترانسفوماسیون را روی آن انجام نداده ایم برای کنترل منفی روی پلییتLB آگار کشت می دهیم به مدت 18 تا 20 ساعت در انکوباتور 37 درجه نگهداری می کنیم.
3-4-3 ارزیابی کلونی ها
پس از 18 تا 20 ساعت پلیت ها را ارزیابی می کنیم، پلیت داری باکتری ترانسفورم شده تشکیل کلونی داد و پلیت حاوی باکتری ترانسفورم نشده نباید تشکیل کلونی دهد چون ژن مقاومت به آنتی بیوتیک را دریافت نکرده است. پس از انکوباسیون در 37 درجه سانتیگراد اندازه کلونی ها به حدود 1 تا 2 میلی متر می رسد . یک تک کلونی را جدا کرده و در 5 میلی لیتر LB براث آمپی سیلین دار تلقیح می نمائیم و به مدت یک شب در 37 درجه و با سرعت مناسب شیکر انکوبه می نمائیم . با رشد باکتری در این محیط تایید می شود که باکتری، پلاسمید حاوی ژن ما را دریافت کرده است.