دانلود پایان نامه

4- باکتری هایی که تازه شده و در فاز لگاریتمی تکثیر می باشند را در چند میکروتیوب استریل تقسیم کرده و 5 الی 10 دقیقه روی یخ نگه می داریم .
5- میکروتیوب ها را 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم.
6- مایع روئی را دور ریخته و رسوب باکتری را در یک میلی لیتر محلول استریل 1/0 مولار کلرید کلسیم حل می کنیم .
7- 20 تا 30 دقیقه محلول مذکور را روی یخ انکوبه می کنیم .
8.سپس محلول را به مدت 3 دقیقه در9000 دور سانتریفیوژ می کنیم. و محلول روی را دور ریخته
9- این بار رسوب را در 600 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل 1/0 مولار حل می کنیم .
10- 20 تا 30 دقیقه محلول را روی یخ انکوبه می کنیم.
11- سپس محلول را به مدت 3 دقیقه در9000 دور سانتریفیوژ می کنیم. و محلول روی را دور ریخته
12- رسوب را در 300 میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل حل میکنیم.
13- به مدت 20 دقیقه محلول را بر روی یخ قرار می دهیم.
این باکتری ها را می توان برای مدت 72 ساعت روی یخ در یخچال نگهداری کرد و همچنین می توان با افزودن گلیسرول استریل 30 درصد آن ها را در 70- درجه سانتیگراد به مدت چند ماه نگهداری کرد .
3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن به روش شوک حرارتی
1- ابتدا 100 میکرولیتر از سلول های مستعد E.coli BL21(DE3) را روی یخ ذوب می کنیم.
2- 30 میکرولیتر از محصول لایگیشن را به 100 میکرولیتر از سلول های مستعد اضافه می کنیم به طوری که کاملا با هم مخلوط شوند.
3- این مخلوط را به مدت 30 دقیقه بر روی یخ انکوبه می کنیم.
4- نمونه ها را به مدت 90 ثانیه در بن ماری 42 درجه سانتیگراد قرار می دهیم و بلافاصله به مدت 5 دقیقه روی یخ قرار می دهیم، بدون حرکت و کاملا ثابت.
5- مخلوط فوق را به 900 میکرولیتر از محیط LB مایع فاقد کانامایسین افزوده و آن را به مدت 5/1 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه قرار می دهیم تا باکتری های ترانسفورم شده بتواند شروع به تکثیر نمایند.
6- مخلوط فوق را به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
7- 800 میکرولیتر از مایع روئی را دور ریخته و رسوب را در 230 میکرولیتر باقی مانده، به خوبی حل می کنیم .
8- 230 میکرولیتر را روی یک پلیت حاوی LB آگار کانامایسین دار ریخته و کشت سه قسمتی می دهیم ، اجازه می دهیم کاملا جذب محیط شده و سپس آن ها را به مدت 18 تا 20 ساعت در انکوباتور 37 درجه نگهداری می کنیم .
3-5-4 ارزیابی کلونی ها
پس از مدت18 تا 20 ساعت در انکوباتور باکتری BL21 بر روی محیط کشت تشکیل کلونی می دهد. یک تک کلونی را جدا کرده و در 5 میلی لیتر محیط LB براث کانامایسین دار تلقیح می نمائیم و به مدت
یک شب در 37 درجه و با سرعت مناسب در شیکر انکوباتور قرار می دهیم. با رشد باکتری در این محیط تایید می شود که باکتری Bl21(DE3) ، پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ما را دریافت کرده است.