منابع مقاله درمورد میزان و مولار

دانلود پایان نامه

به منظور جداسازی باند های پروتئینی سلولی و ردگیری پروتئین نوترکیب در سلول های ترانسفورم شده و نیز میزان بیان پروتئین مورد نظر از الکتروفورز بر روی ژل پلی اکریل آمید استفاده شد و عصاره های سلولی
تهیه شده بر روی SDS-page الکتروفورز شدند. با توجه به این که وزن مولکولی پروتئین نوترکیب حدود 15 کیلو دالتون می باشد از ژل %15 استفاده شد.
3-6-2-1 روش ساخت محلول ها و ژل ها
جهت تهیه ژل ها از مواد زیر استفاده شد:
1) ژل پائین یا ژل جدا کننده
H2O استریل : 1/1 میلی لیتر
اکریل امید %30 : 2 میلی لیتر
تریس 5/1 مولار ( 8/8 = PH ) : 1 میلی لیتر
SDS %10 : 05/0 میلی لیتر
آمونیوم پرسولفات [ APS ] %10 : 05/0 میلی لیتر
تترا متیل اتیلن دی آمین [ TEMED ] : 01/0 میلی لیتر
2) ژل بالا یا ژل متراکم کننده
H2O استریل : 4/1 میلی لیتر
اکریل امید %30 : 4/0 میلی لیتر
تریس 5/0 مولار ( 8/6 = PH ) : 6/0 میلی لیتر
SDS %10 : 05/0 میلی لیتر
آمونیوم پرسولفات [ APS ] %10 : 05/0 میلی لیتر
تترا متیل اتیلن دی آمین [ TEMED ] : 01/0 میلی لیتر
جهت تهیه بافر مخزن، 3 گرم تریس، 4/14 گرم گلایسین و 1 گرم SDS در یک لیتر آب مقطر حل شد. برای تهیه بافر نمونه نیز 10 میلی لیتر از بافر ژل متراکم کننده را با 5 میلی لیتر گلایسین، 1 گرم SDS ، 2/0 میلی لیتر محلول بروموفنول بلو و 1 میلی لیتر 2-مرکاپتواتانول در یک ظرف مخلوط کرده و سپس با آب مقطر به حجم 20 میلی لیتر می رسانیم.
برای تهیه ژل ابتدا صفحات شیشه ای و اسپیسر ها را با آب مقطر و الکل تمیز می کنیم. اسپیسر ها را در کناره های جانبی دو شیشه قرار داده و با گیره به خوبی محکم می کنیم. ابتدا به آرامی محلول ژل پایین را
بین دو شیشه ریخته به طوری که حدود دو سانتیمتر از بالای شیشه را برای ریختن محلول ژل بالا خالی نگه داشته شود. بلافاصله بر روی ژل پائین آب مقطر یا ایزوبوتانل ریخته تا از مجاورت با اکسیژن هوا دور بماند و عمل پلیمریزه شدن به خوبی انجام گیرد. پس از حدود 30 دقیقه که ژل پائین کاملا پلیمریزه شد، آب مقطر را با کاغذ صافی بطور کامل خشک می کنیم. بعد از آن محلول ژل بالا را افزوده و شانه را که از قبل با آب مقطر و الکل شسته شده است را در حد فاصل دو شیشه، درون محلول ژل بالا قرار می دهیم. پس از پلیمریزه شدن ژل بالایی، صفحات شیشه ای را درون بافر تانک قرار داده و شانه در درون بافر از ژل خارج می کنیم.
3-6-2-2 Run کردن نمونه ها
جهت Run کردن نمونه ها، 15 میکرولیتر از مخلوط رسوب باکتری و اوره 8 مولار را با 5 میکرولیتر از بافر نمونه مخلوط کرده و به مدت 5 دقیقه در بن ماری 95 درجه سانتیگراد قرار می دهیم. 20 میکرولیتر از مخلوط مورد نظر را در چاهک ژل ریخته و در ولتاژ اولیه 120 ولت تا خارج شدن از ژل بالایی و 160 ولت برای ژل پایینی الکتروفورز می کنیم. الکتروفورز تا زمانی ادامه پیدا می کند تا رنگ آبی کاملا به کناره پایینی ژل برسد.