منابع مقاله درمورد سانتریفیوژ و محتویات

دانلود پایان نامه

3-5-6 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده
بعد از استخراج پلاسمید بیانی pet-28a که حاوی ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM است که به کمک تکنیک لایگیشن به آن انتقال داده شده است، و برای تایید حضور ژن از جایگاه برش آنزیمی که در دو طرف، ابتدا و انتهای ژن ناحیهC2 پروتئینALCAM در نظر گرفته شده است استفاده می کنیم، برای این منظور از هضم آنزیمی دو گانه استفاده می کنیم سپس محصول هضم آنزیمی دوگانه جهت بررسی بر روی ژل آگارز برده تا قطعات مورد نظر مربوط به پلاسمید و ژن سنتز شده مشاهده شوند.
3-5-6-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion و الکتروفورز
1- یک میکروتیوب 2/0 برمی داریم و محتویات واکنش را به صورت زیر در آن مخلوط می کنیم .
آب استریل: 12 میکرولیتر
بافر تنگو x2 : 4 میکرولیتر
آنزیم NcoI : 1 میکرولیتر
آنزیم XhoI : 1 میکرولیتر
پلاسمید pet-28a نوترکیب: 2 میکرولیتر
حجم نهایی واکنش:20 میکرولیتر
2- میکروتیوب را به مدت 1 الی2 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد ( دمای اپمتیموم واکنش آنزیم ها ) قرار می دهیم .
3-الکتروفورز انجام داده تا قطعات پلاسمید و ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM شناسایی و تایید شوند.
3-6 بیان پروتئین ناحیهC2 پروتئین ALCAM
پس از تائید ترانسفورماسیون و وجود پلاسمید حاوی ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM در باکتری میزبان، با توجه به پروموتر lac در پلاسمید pet-28a ، جهت القاء بیان پروتئین در باکتری از القاگر IPTG در رقت مناسب استفاده شد.
3-6-1 القاء بیان پروتئین به کمک IPTG
1) به 2 میلی لیتر از محیط کشت LB که حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین است ، 20 میکرولیتر از باکتری BL21(DE3) ترانسفورم شده اضافه شد و به مدت یک شب در شیکر انکوباتور 37 درجه سانتیگراد و با سرعت rpm 150 قرار داده شد تا رشد کند.
2) 20 میکرولیتر از مخلوط مرحله قبل به 2 میلی لیتر از محیط کشت LB تازه حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین اضافه شد و به مدت 2 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه سانتیگراد با سرعت rpm 150 قرار داده شد تا غلظت باکتری مورد نظر به OD ، 8/0 برسد. بدین طریق باکتری ها تازه گشته و در فاز لگاریتمی خود قرار دارند.
3) 20 میکرولیتر از القاگر IPTG با غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر به 2 میلی لیتر از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده اضافه شد و سپس به مدت 6 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه سانتیگراد با سرعت rpm 150 قرار داده شد.
نکته:
برای نمونه های کنترل منفی بدون افزوده شدن IPTG مورد بررسی قرار گرفتند.
4) مخلوط مورد نظر به مدت 5 دقیقه در 4 درجه و با سرعت rpm 5000 سانتریفیوژ شد.
5) محلول روئی را دور می ریزیم و به رسوب آن 60 میکرولیتر اوره 8 مولار اضافه شد و به کمک تکنیک SDS-page بیان پروتئین مورد نظر مورد بررسی قرار می دهیم.
3-6-2 بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page