دانلود پایان نامه
3-4-4 استخراج پلاسمید – AMP+ pBSK حاوی DNA ، C2 پروتئین ALCAM
اساس استخراج پلاسمید مبتنی بر لیز قلیایی و متعاقب آن جذب DNA توسط سیلیکا است و سپس جداسازی پلاسمید از ستون می باشد. برای استخراج پلاسمید از کیت تهیه شده از شرکت فرمنتاز لیتوانی استفاده شد . ( شکل 3-10 )
شکل3-10 کیت استخراج پلاسمید
روش کار :
1- از محیط کشتLB مایع حاوی باکتری ترانسفورم شده که به مدت یک شبانه روز در دمای 37 درجه انکوبه شده است و کاملا بصورت کدر درآمده است ، 5/1 میلی لیتر جدا کرده و داخل میکروتیوب 5/1 می ریزیم.
2- سپس به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
3- محیط روئی را دور ریخته و باکتری در ته میکروتیوب رسوب می کند.
نکته:
برای استخراج غلظت بالاتری از پلاسمید می توان مراحل قبل را تا اتمام محیط کشت5 میلی لیتری تکرار کرد.
4- در این مرحله 250 میکرولیتر از بافر محلول کننده که دارای RNAase است به رسوب باکتری اضافه کرده و مخلوط را کاملا هم می زنیم تا رسوبی در ته میکروتیوب باقی نماند و تمامی آن در حلال حل شود.
5- 250 میکرولیتر از محلول لیزکننده به مخلوط اضافه می کنیم سپس آن را 4 تا 6 بار سروته می کنیم تا کاملا مخلوط شود. این بافر کاملا باکتری را لیز می کند.
6- در مرحله ی بعد 350 میکرولیتر از بافر خنثی کننده به مخلوط مرحله قبل اضافه می کنیم . سپس سریعا میکروتیوب را چند بار سر و ته می کنیم تا باکتری های لیز شده به حالت ابری شکل لخته شوند.
7- سپس به مدت 5 دقیقه در 9000 دور محلول را سانتریفیوژ کرده تا قطعات باکتری رسوب کنند.
8- محلول روئی را نگه داشته و رسوب را دور می ریزیم.
9- محلول رویی به ستون استخراج پلاسمید منتقل می کنیم . این ستون حاوی سیلیکا است که پلاسمید را جذب می کند.
10- ستون حاوی محلول را به مدت 1 دقیقه در 12000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
11- محلول روئی را دور می ریزیم.
12- به ستون 500 میکرولیتر بافر شستشو اضافه می کنیم .
13- به مدت 45 ثانیه در 000/12 دور ستون را سانتریفیوژ می کنیم .
14- مرحله12و13 را یک بار دیگر تکرار می کنیم .
15- محلول درون ستون را دور می ریزیم.
16- ستون را به مدت 1 دقیقه دیگر در 000/12 دور سانتریفیوژ می کنیم تا الکل موجود در بافر شستشو که در مرحله ی قبل مورد استفاده قرار گرفت کاملا از ستون خارج شود زیرا الکل مانع واکنش های آنزیمی می باشد.ستون را به مدت 15 دقیقه در دمای محیط قرار می دهیم تا الکل آن به طور کامل تبخیر شود.
17- ستون را درون یک میکروتیوب 5/1 قرار می دهیم و سپس بافر جدا کننده را به میزان 50 میکرولیتر به ستون اضافه می کنیم . بافر جدا کننده دقیقا باید بر روی سیلیکا ریخته شود. 2 الی 3 دقیقه در دمای اتاق ستون را نگه می داریم تا بافر کاملا به سیلیکا نفوذ کند.