منابع مقاله درمورد سانتریفیوژ و استخراج

دانلود پایان نامه

3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ناحیه C2 پروتئیین ALCAM
جهت تایید وجود پلاسمید pet-28a در باکتری و عدم وجود هرگونه آلودگی در محیط کشت نیاز است که وجود پلاسمید مورد نظر تایید شود، بدین منظور از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3) استخراج پلاسمید صورت گرفت.


1- از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده که به مدت یک شبانه روز در دمای 37 درجه انکوبه شده است و کاملا بصورت کدر درآمده است ، 5/1 میلی لیتر جدا کرده و داخل میکروتیوب 5/1 می ریزیم.
2- سپس به مدت 3 دقیقه در 9000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
3- محیط روئی را دور ریخته و باکتری در ته میکروتیوب رسوب می کند .
نکته:
برای استخراج غلظت بالاتری از پلاسمید می توان مراحل قبل را تکرار کرد.
4- در این مرحله 250 میکرولیتر از بافر محلول کننده که دارای RNAase است به رسوب باکتری اضافه کرده و مخلوط را کاملا هم می زنیم تا رسوبی در ته میکروتیوب باقی نماند و تمامی آن در حلال حل شود.
5- 250 میکرولیتر از محلول لیزکننده به مخلوط اضافه می کنیم سپس آن را چند بار سروته می کنیم تا کاملا مخلوط شود . این بافر کاملا باکتری را لیز می کند.
6- در مرحله ی بعد 350 میکرولیتر از بافر خنثی کننده به مخلوط مرحله قبل اضافه می کنیم . سپس سریعا میکروتیوب را چند بار سر و ته می کنیم تا باکتری های لیز شده به حالت ابری شکل لخته شوند.
7- سپس به مدت 5 دقیقه در 9000 دور محلول را سانتریفیوژ کرده تا قطعات باکتری رسوب کنند.
8- محلول روئی را نگه داشته و رسوب را دور می ریزیم.
9- محلول روئی به ستون استخراج پلاسمید منتقل می کنیم . این ستون حاوی سیلیکا است که پلاسمید را جذب می کند.
10- ستون حاوی محلول را به مدت 1 دقیقه در 12000 دور سانتریفیوژ می کنیم .
11- محلول روئی را دور می ریزیم.
12- به ستون 500 میکرولیتر بافر شستشو اضافه می کنیم .
13- به مدت 45 ثانیه در 000/12 دور ستون را سانتریفیوژ می کنیم .
14- مرحله 12 و 13 را یکبار دیگر تکرار می کنیم .
15- محلول درون ستون را دور می ریزیم.
16- ستون را به مدت 1 دقیقه دیگر در 000/12 دور سانتریفیوژ می کنیم تا الکل موجود در بافر شستشو که در مرحله ی قبل مورد استفاده قرار گرفت کاملا از ستون خارج شود زیرا الکل مانع واکنش های آنزیمی می باشد.
17- ستون را درون یک میکروتیوب 5/1 قرار می دهیم و سپس بافر جدا کننده را به میزان 50 میکرولیتر به ستون اضافه می کنیم . بافر جدا کننده دقیقا باید بر روی سیلیکا ریخته شود. 2 الی 3 دقیقه در دمای اتاق ستون را نگه می داریم تا بافر کاملا به سیلیکا نفوذ کند.
18- ستون را در داخل میکروتیوپ 5/1 قرار داده و به مدت 2 دقیقه در 000/12 دور سانتریفیوژ می کنیم
19- ستون را دور ریخته و محلول درون میکروتیوب حاوی پلاسمید استخراج شده است.