دانلود پایان نامه
2) شاخص محتوای G-C
میانگین محتوای G-C یک توالی مناسب بین %30 تا %70 ( بطور میانگین % 50 ) می باشد. شاخص محتوای G-C توالی اولیه از میزان % 55/41 به % 12/51 در توالی بهینه سازی شده افزایش یافت که این امر موجب افزایش نیمه عمر mRNA ناحیه طراحی شده می شود. (شکل 4-3 )
شکل 4-3. شاخص محتوای G-C. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی.
با توجه به پارامتر های تغییر یافته، توالی 422 نوکلئوتیدی نهایی برای ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM در شکل 4-4 نشان داده شده است. همچنین در شکل 4-6 نیز توالی اولیه و توالی بهینه سازی شده را بطور مقایسه ای و نوکلئوتید به نوکلئوتید می توان مشاهده کرد.
شکل 4-4. ترادف ناحیه C2مورد نظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli .
شکل 4-5. مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی شده.
4-2 سنتز شیمیایی DNA ناحیه C2
توالی مورد نظر توسط شرکت Biomatik کانادا بصورت شیمیایی سنتز شد و درون وکتور pBSK قرار داده شد . این وکتور قبلا به نام pBMH شناخته می شد که طولی برابر با bp 2907 دارد. این وکتور دارای ژن مقاومت به آنتی بیوتیک آمپی سیلین می باشد که می توان از آن برای جداسازی کلونی های
نوترکیب استفاده کرد. طول توالی بعد از سنتز ژن به داخل پلاسمید به bp 3725 رسید. توالی سنتز شده تمام مراحل کنترلی کیفیت را با موفقیت گذارند. از جمله این مراحل می توان به موارد زیر اشاره کرد.
– تائید صحت توالی ژن نوترکیب
– تائید صحت توالی پلاسمید حامل
– تائید صحت شکل خواندن ( Reading Frame ) در فرایند رونویسی
– تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم آنزیمی ( شکل 4-6 )
Quality control:
Gene name:C ext
Clone ID#:D5305-4
RES: HindIII
شکل 4-6. تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم آنزیمی
– تائید صحت قابلیت تکثیر ژن به کمک تکنیک PCR و عدم وجود هرگونه آلودگی در آن
– کیفیت مناسب DNA سنتز شده به کمک تکنیک اسپکتروسکوپی و عدم وجود هرگونه آلودگی در آن
– شکل ظاهری شفاف و عدم وجود هرگونه ذره ی خارجی در آن
سفارش مذکور به شکل پودر لیوفیلیزه و در حجم 10 میکروگرم دریافت شد و سپس با توجه به دستور العمل شرکت سازنده بصورت استوک قابل استفاده درآمد. نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNA ناحیه C2در شکل 4-7 نمایش داده شده است. در این شکل جایگاه ژن مورد نظر، نحوه قرار گیری آن در
پلاسمید حامل، جایگاه های آنزیم های محدود کننده و همچنین جایگاه ژن مقاومت به آنتی بیوتیک آمپی سیلین نشان داده شده است.