دانلود پایان نامه

3-6-2-3 رنگ آمیزی با کوماسی G-250 کلوئیدی
رنگ آمیزی با محلول کلوئیدی G-250 بر اساس روش بلاکسلی و بوئر با بعضی تغییرات انجام شد. با توجه به حالت کلوئیدی کوماسی در این روش زمینه ی ژل آنچنان رنگ نمی گیرد. حساسیت این روش بارها بیش از روش رنگ آمیزی با کوماسی R250 و در حدود 20 تا 30 نانوگرم پروتئین در هر باند است. در ضمن برای رنگ آمیزی پلی پپتید های کوچک روش مناسبی می باشد.جهت رنگ آمیزی از محلول های زیر استفاده شد :
1) محلول ثبوت ( تری کلرو استیک اسید % 20 ) : 20 گرم تری کلرو استیک اسید را در آب مقطر حل کرده، حجم نهایی را به 100 میلی لیتر می رسانیم.
2) محلول رنگ آمیزی: 4/0 گرم کوماسی بلو G-250 را در 200 میلی لیتر آب مقطر حل می کنیم. سپس 200 میلی لیتر محلول اسید سولفوریک 1 مولار اضافه کرده، 3 ساعت با همزن مغناطیسی هم می زنیم. محلول را با کاغذ صافی، صاف می کنیم. سپس به ترتیب 45 میلی لیتر محلول هیدروکسید پتاسیم 10 مولار و60 میلی لیتر محلول تری کلرو استیک اسید خالص اضافه می کنیم. محلول را در دمای اتاق و به دور از نور می توان نگهداری کرد.
روش رنگ آمیزی به صورت زیر است:
1) ژل را در یک ظرف شیشه ای یا پلاستیکی درب دار قرار می دهیم. مقدار کافی محلول ثبوت اضافه می کنیم و حداقل به مدت 1 ساعت روی شیکر با حرکت آرام قرار می دهیم.
2) محلول ثبوت را بطور کامل تخلیه می کنیم. مقدار کافی محلول رنگ آمیزی اضافه می کنیم و ظرف را به مدت 3 ساعت در دمای 45 تا 50 درجه سانتیگراد یا به مدت 12 ساعت در دمای اتاق روی شیکر با حرکت آرام قرار می دهیم.
3) ژل را در به مدت 1 تا 2 ساعت با آب مقطر شستشو می دهیم تا زمینه شفاف گردد.
فصل چهارم : نتایج
4-1 نتایج حاصل از بهینه سازی توالی یا Optimization
در توالی نوکلئوتیدی اولیه پارامتر هایی وجود دارد که کارایی سیستم بیانی در میزبان E.coli را پایین می آورد. در نتیجه این پارامتر ها با جایگزینی نوکلئوتید های مناسب و ایجاد کدون هایی با راندمان بالا بهینه سازی شد. در تغییرات ایجاد شده نکات زیر مورد توجه قرار گرفت:
– هیچ اسید آمینه ای تغییر نکند.
– با توجه به دو قسمتی بودن پروتئین مورد نظر، تا حد امکان ساختار هر بخش پروتئینی در شکل نهایی تغییر ننماید.
– قالب خواندنی در ژن نهایی تغییر نکند.
– کدون هایی انتخاب شود که بیشترین بیان را در میزبان داشته باشد.
– پایداری mRNA مورد بررسی و توجه قرار گیرد.
– جایگاه های آنزیم های محدود کننده در دو سر توالی بدون تغییر بماند.
پارامتر هایی که طی بهینه سازی دستخوش تغییر قرار گرفتند به شرح زیر می باشد :
) شاخص سازگاری کدون یا ( CAI ) :
از لحاظ کمی مقدار تمایل کدونی، کدون های مترادف با استفاده از شاخص سازگاری کدونی یا CAI اندازه گیری می شود که بین صفر تا یک متغیر است. زمانی که این شاخص برابر صفر باشد به این معناست که همه کدون های مترادف به یک میزان در یک ژن استفاده شده اند و مقدار برابر یک به معنای حداکثر بودن میزان تمایل کدونی بوده و در این مورد فقط کدون های بهینه مورد استفاده قرار گرفته اند که بالطبع آن نشان دهنده بیان بیشتر و دائم یک ژن و به عبارتی تعیین کننده سطح بیان آن خواهد بود. با توجه به این پارامتر میزان CAI برابر با یک، بهترین حالت بیانی ممکن و بیشتر از 8/0 حالت بیانی خوب و 6/0 ، حالت بیانی متوسط را دارا خواهند بود. در توالی اولیه طراحی شده میزان CAI برابر با 60/0 بود که با تغییرات نوکلئوتیدی اعمال شده این میزان به 88/0 تغییر یافت. (شکل 4-2 )
شکل 4-1. شاخص سازگاری کدون. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی
بدین ترتیب میزان فراوانی کدون های بهینه (FOP ) نیز افزایش یافت به صورتی که کدون های کاملا اپتیموم برای توالی آمینواسیدی در نظر گرفته شده از %41 در توالی اولیه به %69 در توالی بهینه شده افزایش یافتند. دیگر کدون ها هم در بهترین حالتی که در توالی می توانستند حضور یابند به صورت بهینه در آمدند. FOP اپتیموم نشان گر بیان کاملا دقیق کدون های کد کننده آمینو اسید ها هستند، بدین معنی که با توجه به میزان تغییراتی که در کل توالی می تواند صورت گیرد، برای یک آمینو اسید خاص، این کدون در میزبان بالاترین راندمان بیانی را می تواند داشته باشد. (شکل 4-2)
شکل 4-2. میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ: قبل از بهینه سازی، سمت راست: بعد از بهینه سازی