دانلود پایان نامه

3-4- ارزیابی مقاومت ژنوتیپهای آفتابگردان نسبت به M. phaseolina در شرایط آزمایشگاه
در این آزمایش عکس العمل سه جدایه قارچ M. phaseolina از آفتابگردان(جدایه Su3)، سویا (جدایه (So3 و کنجد (جدایه Se3) برروی10 ژنوتیپ آفتابگردان بررسی شدند. آزمایش درقالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار اجرا گردید. هر تکرار شامل 2 پتری حاوی 6 عدد بذر آفتابگردان بود. در این روش ابتدا بذر ژنوتیپ های مختلف توسط هیپوکلریت سدیم 2 درصد به مدت 4 دقیقه ضدعفونی و سپس با آب مقطر استریل 2 مرتبه هر بار به مدت 3 تا 4 دقیقه شستشو داده شدند. سپس بذور هر یک از ژنوتیپ ها بر روی محیط کشت 6 روزه قارچ M. phaseolina قرار گرفتند. نمونه ها در دمای 2 ± 28 درجه سانتی گراد در شرایط تاریکی در داخل انکوباتور نگهداری شدند. ارزیابی نمونه ها 6 روز پس از قرار دادن بذر ها در پتری حاوی قارچ عامل بیماری صورت گرفت. در این روش ارزیابی شدت بیماری (Disease Severity) بر اساس روش مانیسی (Manici, 1992) به شرح ذیل صورت گرفت :
0= بذر سالم
1= تغییر رنگ بر روی قسمتی از گیاهچه که در تماس با میسلیوم قارچ قرار دارد.
2= پوسته بذر توسط میسلیوم و اسکلروت مورد حمله قرار گرفته ولی گیاهچه سالم است.
3= پوسته بذر عاری از قارچ بوده اما گیاهچه سالم است.
4= پوسته بذر و گیاهچه آلوده است.
5= بذر آلوده شده و جوانه زنی صورت نگرفته است.
در این روش شاخص بیماری (Disease Index) با مجموع حاصل ضرب تعداد بذر ها در درجه شدت بیماری (Disease Severity) محاسبه گردید(شکل 3-6، 3-7 ).

شکل 3-6- عکس العمل ژنوتیپ های مختلف آفتابگردان نسبت به سه جدایه M. phaseolina از سویا (1)، آفتابگردان (2) ، کنجد (3) و تیمار شاهد (4) در شرایط آزمایشگاه

مطلب مرتبط :   تحقیق درمورد خروجی های نرم افزار و توسط نرم افزار

شکل 3-7- نگهداری ژنوتیپهای مورد ارزیابی آفتابگردان نسبت به قارچ M. phaseolina درانکوباتور
3-5- ارزیابی مقاومت ژنوتیپهای آفتابگردان نسبت به قارچM. phaseolina در شرایط گلخانه
برای ارزیابی در گلخانه، 360 گرم ماسه دانه ریز با 40 گرم آرد ذرت و 40 میلی لیتر آب مقطر به طور کامل مخلوط شد. این مخلوط در ظروف یک لیتری ریخته و در دو نوبت، هر بار به مدت نیم ساعت اتوکلاو و سپس با کشت 5 روزه قارچ M. phaseolina (جدایه Su5) که بیماری زایی آن اثبات شده تلقیح شد و در دمای 25 درجه سانتی گراد به مدت 1 ماه نگهداری شد (منتظر نیا، 1387). مایه تهیه شده با خاک سترون گلدانی (خاک برگ، ماسه و خاک به مقدار مساوی) به نسبت 1:9 مخلوط شدند و گلدان ها با آن پر شدند. بذر سالم ژنوتیپ های انتخاب شده آفتابگردان پس از ضدعفونی سطحی در گلدان ها کاشته شدند و در ایستگاه تحقیقاتی قراخیل در دمای 2±25 درجه سانتی گراد نگهداری شدند و بعد از 3 هفته درصد آلودگی با روش اشتینبرگ (Schteinberg, 1997) تعیین شد. در این ارزیابی هر 3 گلدان حاوی 5 بوته آفتابگردان، به عنوان یک تکرار در نظرگرفته شد. آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با 3 تکرار به اجرا در آمد ( شکل 3-9 ، 3-10).

شکل 3-8- مخلوط ماسه دانه ریز، آرد ذرت، آب مقطر و کشت 5 روزه قارچ M. phaseolina

شکل 3-9- گلدانهای آفتابگردان آلوده به بیماری پوسیدگی زغالی(سمت راست) وگلدان تیمار شاهد (سمت چپ) در گلخانه ایستگاه تحقیقاتی قراخیل
3-6- انتخاب مزرعه آلوده و جدا کردن میکرواسکلروت قارچ M. phaseolina
به منظور یافتن مزرعه آلوده به قارچ عامل بیماری جهت ارزیابی ارقام، 10 مزرعه آفتابگردان واقع در شهرستان های ساری، نکا و بهشهر انتخاب و جمعیت میکرواسکلروت های قارچ عامل بیماری بر اساس روش سینک و همکاران (Singh et al., 1990) تعیین گردید. در این روش از هر مزرعه 5 نمونه خاک از عمق 0 تا 20 سانتی متری به وزن 1 کیلوگرم به صورت تصادفی برداشته شد و در آون با حرارت 30 درجه سانتی گراد به مدت 48 ساعت خشک و سپس خرد و غربال شد. یک گرم از خاک هر نمونه در 250 میلی لیتر محلول 1 درصد هیپوکلریت سدیم در آب مقطر سترون ریخته و توسط شیکر (129 دور در دقیقه) مخلوط شد. مخلوط حاصل از الک با مش 45 میکرون عبور داده و با جریان آب شستشو شد باقی مانده روی الک با آب مقطر استریل شستشو و در ارلن مایر 250 میلی لیتری ریخته شده و حجم نهایی آن با آب مقطر استریل به 10-5 میلی لیتر رسانده شد. محلول فوق با 100 میلی لیتر محیط انتخابی Molten مخلوط شد. مخلوط نهایی به بشقابک های سترون منتقل شده و در حرارت 30 درجه سانتی گراد در تاریکی به مدت 5-4 روز نگهداری و سپس جمعیت میکرواسکلروت های زنده شمارش شد.
3-7- ارزیابی مقاومت ژنوتیپ های آفتابگردان نسبت به قارچ M. phaseolina در شرایط مزرعه