دانلود پایان نامه
اکتینومیست‌ها می‌توانند برای تولید صنعتی ترکیبات بیولوژیکی فعال مانند آنزیم‌ها بررسی شوند. در این پژوهش فعالیت پروتئازی و آمیلازی اکتینومیست‌های فعال بررسی شد. برای بررسی فعالیت پروتئازی از محیط کشت ISP2 حاوی یک درصد Skimmed milk استفاده شد. جدایه‌های فعال به صورت خطی روی محیط کشت، تلقیح شدند و 24 ساعت در دمای 28 درجه گرم‌خانه‌گذاری شدند. وجود هاله‌ی شفاف اطراف کلنی‌ها نشانه تجزیه پروتئین توسط جدایه بود. همچنین فعالیت آمیلازی جدایه‌ها در محیط کشت ISP2 حاوی 1% نشاسته بررسی شد. بعد از گرماگذاری پلیت‌های تلقیح شده به مدت 24 ساعت در دمای 28 درجه، با افزودن ید به محیط کشت وجود هاله شفاف اطراف کلنی‌ها‌ نشانه‌ی توانایی تجزیه نشاسته توسط جدایه بود (Das, 2010).
2-13- استخراج نوکلئیک اسید به روش بیدبیتر
این روش می تواند برای استخراج DNA از نمونه‌های خاک، آب و محیط‌های کشت، به کار برده شود. باکتری‌های رشد کرده در محیط کشت LB مایع به مدت 10 دقیقه درrpm 4000 سانتریفوژ شد. مایع رویی دور ریخته و 6/0 میلی لیتر CTAB به رسوب اضافه شد و به لوله اپندورف منتقل گردید. 5/0 میلی لیتر از مخلوط فنل: کلروفرم:ایزوامیل الکل (به نسبت 1:24:25) به آن اضافه شد و سپس به مدت 2 دقیقه ورتکس گردید. مخلوط فنل:کلروفرم ایزوامیل الکل با بخش های آبگریز پروتئین‌‌ها و لیپید‌ها بر هم کنش داده و سبب دناتوره شدن و در نتیجه رسوب آن‌ها می‌شود. محتوی لوله اپندورف به لوله‌های 2 میلی لیتری در پیچ‌دار حاوی 5/0- 1 گرم بید های سیلیکا/ زیرکونیا منتقل شد. لوله‌ها در دستگاه بیدبیتر با دور 5000 به مدت 2 دقیقه قرار داده شد. ضربات بیدها باعث شکست بیشتر و بهتر دیواره سلولی باکتری‌ها می‌شود. سپس لوله‌ها به مدت 5 دقیقه درrpm 13000 سانتریفیوژ شدند. فاز آبی که در قسمت بالای ویال قرار دارد و دارای DNA می‌باشد به کمک میکروپیپت به لوله‌های اپندورف جدید، انتقال یافت. سپس حدود یک میلی لیتر محلول PEG به آن اضافه شد و در دمای اتاق به مدت 24- 2 ساعت گذاشته شد.
برای رسوب نوکلئیک اسید، لوله‌ها درrpm 13000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شد. محلول رویی دور ریخته شد و رسوب آن با 1 ml اتانول خالص شستشو داده شد. اتانول سبب آبگیری از DNA و رسوب بهتر و بیشتر آن می‌شود. سپس لوله‌ها درrpm 13000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شد. محلول رویی دور ریخته شد و رسوب آن در مجاورت هوا خشک گردید. سپس رسوب (نوکلئیک اسید) در 40 میکرولیتر آب عاری از نوکلئاز کاملا حل شد و در فریزر 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد (Sambrook & Russell.,2006).
2-14- الکتروفورز با ژل آگارز 8/0 درصد
الکتروفورز افقی برای ژل آگاروز، از یک منبع انرژی و تانک الکتروفورز تشکیل شده است. برای بررسی کیفی DNA استخراج شده از این دستگاه استفاده می‌شود. در این دستگاه، چاهک‌های برای بارگیری DNA در قطب منفی وجود دارند. مولکول DNA به دلیل داشتن بار منفی، به سمت قطب مثبت حرکت می‌کند. در الکتروفورز قطعات DNA بر اساس اندازه، شکل فضایی و وزن جدا می‌شوند.
به کمک حرارت، 8/. گرم آگاروز در 100 میلی‌لیتر بافر TBE حل شد. پس از رسیدن دمای آگاروز محلول به 40 درجه سانتی‌گراد، 4 میکرولیتر اتیدیوم برماید به آن اضافه شد. سپس این محلول درون سینی مخصوص الکتروفورز ریخته شد. دقت شود این محلول فاقد حباب و ناهمواری باشد. سپس شانه مخصوص ژل داخل محلول قرار داده شد و ژل در دمای آزمایشگاه سفت شد. مقدار 5 میکرولیتر نمونه DNA با یک میکرولیتر بافر بارگذارنده مخلوط شد و به کمک میکروپیپت داخل چاهک بارگذاری گردید. سپس 5 میکرولیتر از خط کش ژنی با یک میکرولیتر بافر بارگذارنده مخلوط شده و در چاهک بارگذاری شد. الکتروفورز در 70 ولت و زمان 55 دقیقه انجام شد. سپس ژل اگاروز به کمک ژل داک بررسی شد.
2-15- تکثیر ژن rDNA 16S
برای شناسایی مولکولی جدایه‌های اکتینومیست، ژن rDNA 16S توسط واکنش زنجیره‌ای (PCR) تکثیر شد. به این مظور از پرایمرهای عمومی PA و PH استفاده شد. توالی پرایمرها در جدول 2-3 خلاصه شده است.
جدول 1 -3- توالی پرایمرهای PA و PH برای واکنش زنجیره‌ای پلیمراز
5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ PA forward
5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′ PH reverse

مطلب مرتبط :   دانلود پایان نامه ارشد با موضوع استفاده از فناوری و توسعه تکنولوژی

2-15-1- برنامه PCR برای ژن‌های 16S rDNA:
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ژن 16S rDNA برای اکتینومیست‌های فعال، مطابق برنامه‌ی زیر انجام شد(Edwards, 1989). دمای دناتوراسیون اولیه C° 95 و به مدت 5 دقیقه بود. سپس 35 چرخه شامل یک دقیقه دمای C° 95، یک دقیقه دمای C° 50 و یک و نیم دقیقه دمای C° 72 انجام شد. در نهایت برای تکمیل واکنش ساخت DNA، دما به مدت 5 دقیقه در C° 72 نگه داشته شد. درستی انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ژن‌ 16S rDNA با الکتروفورز ژل آگاروز 8/0 درصد رنگ آمیزی شده با اتیدیوم برماید تأیید شد.
2-15-2- تخلیص محصول PCR
برای خالص‌سازی، از کیت تخلیص محصول PCR، Thrmo Scientific، استفاده شد. طبق پروتکل کیت ابتدا حجم 1:1 از بافر باند شونده ، به مخلوط کامل محصول PCR اضافه شد. تا محلول زرد رنگی ایجاد شود. این رنگ، نشان دهنده‌ی pH مناسب برای اتصال DNA به ستون است. در صورتی که قطعات DNA کوچکتر یا مساوی 500 جفت باز باشد، حجمی برابر محصول PCR نیز از ایزوپروپانول 100% به مخلوط اضافه شد. سپس از محلول مرحله‌ی قبل به ستون‌ها تخلیص GeneJET، انتقال یافت و به مدت 30-60 ثانیه در rpm10000 سانتریفوژ شد. محلول جمع شده در انتهای ستون دور ریخته شد. حجم 700 میکرولیتر از بافر شستشو، به ستون تخلیص GeneJET، اضافه شد و به مدت 60 ثانیه در rpm10000 سانتریفیوژ شد. محلول جمع شده در انتهای ستون دور ریخته شد. ستون تخلیص GeneJET خالی به مدت 1 دقیقه برای دور ریختن کامل بافر شستشو سانتریفیوژ شد. در مرحله ششم، ستون خالص‌سازی GeneJET، به یک لوله 5/1 میلی‌لیتری تمیز منتقل شد. سپس 30 میکرولیتر از بافر حل کننده ، به مرکز ستون تخلیص GeneJET، اضافه شده و به مدت یک دقیقه سانتریفوژ گردید. DNA خالص شده، برای مطالعه بعدی در 20- درجه‌ی سانتی‌گراد، ذخیره شد.
2-16- بررسی مولکولی ژن 16S rDNA
2-16-1- تعیین توالی ژن 16S rDNA:
برای تعیین توالی 16S rDNA، محصولات تخلیص شده PCR به شرکت GATC آلمان فرستاده شد. سپس نتایج توالی نوکلئوتیدها به کمک نرم افزار Chromas Lite, 2001 مجددا بررسی شد تا از اشتباهات احتمالی خوانش نوکلئوتیدها اجتناب شود.
2-16-2- انجام BLAST
برای مقایسه توالی ژن 16S rDNA باکتری‌ها، ازسایت EzTaxon وابسته به بانک اطلاعاتی NCBI استفاده شد. برای انجام BLAST، توالی نوکلئوتیدهای ژن 16S rDNA باکتری‌های فعال جدا شده با سایر باکتری‌های موجود در بانک اطلاعاتی مقایسه شد. سایت EzTaxon برای ژن 16S rDNA طراحی شده است و صحت توالی‌های ثبت شده مورد ارزیابی قرار می‌گیرد.