دانلود پایان نامه

2-16-3- رسم درخت فیلوژنی ژن 16S rDNA
برای رسم درخت فیلوژنی باکتری‌ها بر اساس توالی نوکلئوتیدی ژن 16S rDNA، از نرم افزارهای مختلفی استفاده شد. توالی‌های 16S rDNA باکتری‌های مشابه به کمک نرم افزار clustalX، به همراه باکتری‌های اکتینومیست جدا شده، هم‌ردیف‌سازی شد. سپس با استفاده از نرم افزار BioEdit، ابتدا و انتهای توالی‌ها بریده شد. این توالی‌ها به نرم افزار Mega5 منتقل شد و درخت فیلوژنی آن رسم شد.

فصل سوم


نتایج
3- نتایج
3-1- جداسازی اکتینومیست‌ها
در این پژوهش از هر عمق، تعداد 10 نمونه رسوب بستر دریا جمع‌آوری و بررسی شد. کلنی‌های اکتیومیست پس از دو هفته روی محیط کشت اختصاصیSCA و ISP2 نمایان شد. از بین رسوبات اعماق مختلف دریا، تعداد 80 جدایه اکتینومیست به صورت کلنی‌های پودری و خشک، در سطح آگار جداسازی شدند. جدایه‌ها خالص سازی شده و به نام MN1 تا MN80 نام‌گذاری شدند. تعداد 30 جدایه‌ از عمق 5 متر و 50 جدایه‌ از عمق 10 متر از بستر دریا جداسازی شد (شکل 3-1). خصوصیات مورفولوژی کلنی جدایه‌ها شامل ظاهر کلنی، رنگ پشت و سطح کلنی، شکل میکروسکوپی میسلیوم‌ هوایی بررسی شد. نتایج رنگ آمیزی، بررسی میکروسکوپی و ماکروسکوپی کلنی‌ها ثبت شد (شکل3-2).

شکل3- 1. درصد فراوانی جدایه‌های اکتینومیست جداشده از نمونه‌ رسوبات بستر دریا بر حسب عمق آب

شکل 3-2 سویه MN2 جداشده از رسوبات بستر دریای مازندران: رنگ و شکل کلنی اکتینومیست رشد کرده روی محیط کشت اختصاصی SCA (a) و تصویر میکروسکوپی میسلیوم‌(b).
3-2- غربالگری اولیه جهت شناخت جدایه‌های فعال
برای شناسایی سویه‌های فعال، از بین 80 جدایه رسوبات بستر دریا، غربالگری باروش Cross Streak انجام شد. نتایج نشان داد از بین 80 جدایه، تعداد 44 جدایه دارای فعالیت ضد میکروبی علیه حداقل یک باکتری پاتوژن بود. نتایج فعالیت ضد باکتریایی غربالگری اولیه در جدول 3-1 نشان داده شد. از بین این جدایه‌های فعال، تعداد 7 جدایه با بهترین خاصیت ضد میکروبی به نام‌هایMN2 ،MN3 ،MN38 ، MN39،MN44، MN40 وMN41 برای غربالگری ثانویه و ادامه کار انتخاب شدند (جدول3-1). هر هفت جدایه‌ی منتخب نسبت به تمام سویه‌های پاتوژن ممانعت رشد نشان دادند. نتایج شکل 3-3 نشان داد که بیش از 55% جدایه‌‌ها در غربالگری اولیه فعالیت خوبی علیه باکتری‌های پاتوژن داشتند. شکل 3-4 غربالگری اولیه جداشده، در غربالگری اولیه با روش Cross Streak را نشان می‌دهد. همان طور که در شکل مشاهده می شود متابولیت‌های تولید شده توسط جدایه MN2 از رشد باکتری‌های پاتوژن ممانعت به عمل آورده و هاله ممانعت رشد به وضوح دیده می‌شود. علیه سویه‌های پاتوژن فعالیت نشان دادند (شکل3-2). نتایج غربالگری اولیه نشان داد جدایه‌های فعال، دارای خاصیت ضد باکتریایی بیشتری علیه باکتری‌های گرم مثبت نسبت به گرم منفی بودند (جدول3- 1). در این آزمایش جدایه MN2 دارای بیشترین فعالیت علیه کلبسیلا پنومونیه (2/0±17)؛ جدایه MN3 دارای بیشترین فعالیت علیه سودوموناس آئروجینوزا (2/0±20) جدایه MN38 دارای بیشترین فعالیت علیه باسیلوس سوبتیلیس (2/0±27)، استافیلوکوکوس اورئوس (5/0±20) و اشریشیا کولی (3/0±20)؛ جدایه MN39 دارای بیشترین فعالیت علیه کلبسیلا پنومونیه (1/0±24)، اشریشیا کولی (4/0±23) و باسیلوس سوبتیلیس (2/0±23)؛ جدایه MN40 دارای بیشترین فعالیت علیه سالمونلا تیفی (3/0±18)؛ جدایه MN41 دارای بیشترین فعالیت علیه اشریشیا کولی (4/0±20)؛ جدایه MN44 دارای بیشترین فعالیت علیه استافیلوکوکوس اورئوس (2/0±20) و سالمونلا تیفی (2/0±20) را نشان دادند (شکل3-2).
جدول3- 1. غربالگری اولیه اکتینومیست‌های جداشده از رسوبات بستر دریا با روش cross-streak.
باکتری‌های بیماریزا
E. coli B. subtilis K. pneumonia S. aureus S. typhi P. aeruginos جدایه‌ها
– + – + – + MN1
+ + + + + + MN2
+ + + + + + MN3
– – – + – – MN4
+ – – – + – MN5