دانلود پایان نامه با موضوع اندازه گیری و مورفولوژی

دانلود پایان نامه

2-7-1- بررسی مورفولوژی
برای شناسایی اکتینومیست‌ها ابتدا مورفولوژی کلنی با استفاده از استریو میکروسکوپ Nikon مدل TN-PSE 30، بررسی شدند. رنگ پشت و روی کلنی، سفت و پودری بودن کلنی و دیگر خصوصیات مورفولوژیکی کلنی‌ها بررسی شد (Shirling, 1966).
2-7-2- بررسی مورفولوژی باکتریایی و رنگ‌آمیزی گرم
برای بررسی باکتری‌ها از نظر شکل، آرایش و اندازه سلول، از رنگ‌آمیزی گرم استفاده شد. همچنین برای بررسی آرایش اسپورها از محیط کشت ISP2 استفاده شد. پلیت‌های باکتری در فویل پیچیده شد و به مدت یک هفته در تاریکی گرمخانه‌گذاری شد تا اسپورهای رویشی، رنگ کلنی و مورفولوژی اسپور‌ها قابل مشاهده شوند (Shirling, 1966).
پس از تهیه‌‌ی گستره از کلنی باکتری‌ها و تثبیت آن، از روش استاندارد رنگ‌آمیزی گرم استفاده شد. گستره با چند قطره رنگ کریستال ویوله به مدت یک دقیقه پوشانده شد.لام با آب شستشو داده شده تا رنگ کریستال ویوله اضافی زدوده شود. سپس گستره با چند قطره محلول لوگل به مدت یک دقیقه پوشانده شد. پس از شستشو با آب، عمل رنگ بری با اتانول درصد 96 انجام شد. لام با زاویه 45 درجه نگه داشته شده و محلول رنگ بر قطره قطره روی گستره ریخته شد تا زمانی که آخرین قطره رنگی از گستره خارج شود. سپس گستره به مدت نیم دقیقه با سافرانین رنگ‌آمیزی شد، پس از شستشوی گستره با آب و خشک شدن آن، گستره با قطره‌ای از روغن ایمرسیون در زیر میکروسکوپ با عدسی شیئی روغنی (100x) مشاهده شد. مورفولوژی باکتری‌ها و شکل آرایش اسپورها و واکنش گرم به کمک میکروسکوپ Krruss MVL2000 مورد مطالعه قرار گرفت.
2-7-3-تولید پیگمان محلول
برای بررسی تولید پیگمان توسط سویه‌های فعال از محیط کشت مایع Tryptone-yeast extract (حاوی : 5 گرم باکتوتریپتون، 3 گرم عصاره مخمر در یک لیتر آب) استفاده شد. سویه‌های فعال در محیط کشت تلقیح شدند و در گرم‌خانه شیکردار با دمای 28 درجه و دور rpm 180 به مدت یک هفته گرمخانه‌گذاری شدند. بعد این مدت تولید پیگمان در محیط بررسی و ثبت شد (1966 Shirling,).
2-8-غربالگری اولیه اکتینومیست های دارای فعالیت ضد باکتریایی
برای غربالگری اولیه اکتینومیست‌های فعال از روش Cross Streak استفاده شد. کلنی‌ها با منظر مورفولوژیکی شبیه اکتینومیست‌ها انتخاب شدند. برای جداسازی اکتینومیست‌های فعال از نظر تولید فرآورده‌های متابولیکی، غربالگری جدایه‌ها در دو مرحله جداگانه انجام شد. برای غربالگری اولیه بررسی فعالیت ضد باکتریایی جدایه‌ها، هر سویه در مرکز پلیت نوترین اگار به صورت یک خط مستقیم کشت داده شد و بعد پلیت ها به مدت 3 روز در 28 درجه گرماگذاری شدند. سویه های بیماریزای مورد مطالعه شامل اشریشیا کولی PTCC 1533 ، سالمونلا تیفی PTCC 1609 ، باسیلوس سوبتیلیس PTCC 1156 ، استافیلوکوکوس اورئوس ATCC 25923 ، سودوموناس آئروجینوزا و کلبسیلا پنومونیه به صورت یک خط عمود بر خط اصلی، کشت داده شد. پلیت ها مجددا به مدت 24 ساعت در 37 درجه، گرما گذاری شدند. سپس هاله‌ی عدم رشد بر حسب میلی‌متر اندازه گیری شد. بهترین سویه‌ها از نظر فعالیت ضد باکتریایی برای مرحله بعد انتخاب شدند (Valli, 2010).
2-9- استخراج عصاره خام جدایه‌های فعال اکتینومیست
برای استخراج عصاره خام از حلال آلی استفاده شد. با توجه به اینکه آنتی بیوتیک‌ها ترکیبات آلی می‌باشند در نتیجه قابلیت انحلال در حلال‌های آلی را دارند. برای استخراج آنتی بیوتیک از محیط کشت از بین حلال‌های آلی مختلف حلال غیر قطبی اتیل استات استفاده شد.
برای استخراج متابولیت‌های ضد‌میکروبی، سویه‌های فعال اکتینومیست در ml 100 محیط مایع Actinomycete Isolation Medium (شامل 5 گرم گلیسرول، 4 گرم سدیم پروپیونات، 2 گرم سدیم کازئینات، 5/0 گرم پتاسیم فسفات، 1/0 گرم آسپارژین، 1/0 گرم منزیم سولفات، 001/0 گرم سولفات آهن) تلقیح شد (Valli, 2012). برای تولید ترکیبات ضد قارچی، ارلن‌ها در دمای 28 درجه به مدت7 روز در گرمخانه شیکر‌دار با دور rpm 180 قرار داده شدند. میسلیوم‌ها از فاز مایع، به وسیله فیلتر واتمن جداسازی و در rpm 5000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد. برای استخراج متابولیت‌های ثانویه ضدمیکروبی از حلال آلی اتیل استات استفاده شد (Jianyou, 2010). یک برابر حجم سوپرناتانت بدست آمده از هر سویه، اتیل استات به آن اضافه شد. فاز آلی حاوی ترکیبات آنتی بیوتیک، توسط قیف جداکننده جدا و به کمک حرارت در حمام آب گرم تغلیظ شد. از عصاره خام استخراج شده برای بررسی فعالیت ضد میکروبی سویه‌ها استفاده شد (Singh and Baruah ,2006).
2-10-غربالگری ثانویه برای یافتن متابولیت‌های ضد میکروبی
2-10-1-بررسی فعالیت ضد باکتریایی سویه‌های فعال
برای گزینش ثانویه جدایه‌ها فعال، از روش انتشار در دیسک استفاده شد. از عصاره خام استخراج شده استفاده شد (Kirby-Bauer, 1979). برای تهیه کشت تازه باکتری‌های پاتوژن در محیط کشت مایع LB تلقیح شد و در دمای 37 درجه به مدت 24 ساعت گرماگذاری شد. از هر سویه پاتوژن غلظت استاندارد نیم مک فارلند تهیه شد و به کمک سوآب استریل کشت متراکم باکتری روی محیط کشت مولر هینتون آگار تهیه شد. دیسک‌های کاغذی استریل (قطر mm 6، پادتن، ایران) آغشته به عصاره خام روی سطح محیط کشت قرار داده شد. از دیسک آنتی بیوتیک تتراسایکلین به عنوان کنترل مثبت، دیسک خالی به عنوان کنترل منفی و دیسک آغشته به اتیل استات به عنوان کنترل حلال استفاده شد. پلیت‌ها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه گرمخانه‌گذاری و هاله عدم رشد (بر حسب میلی متر) در اطراف دیسک‌ها، اندازه‌گیری شد.
2-11-2-بررسی فعالیت ضد قارچی سویه‌های فعال
بررسی اثرات آنتاگونیسمی و ضد قارچی عصاره خام حاصل از اکتینومیست‌های جداشده، به روش انتشار در دیسک انجام شد (Kumar, 2011). در این آزمایش اثر ضد قارچی سویه‌ها علیه قارچ‌های استاندارد شامل کاندیدا آلبیکنس 6027PTCC ، کاندیدا کروزئی 6258PTCC ، آسپرژیلوس نایجر ، آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس فومیگاتوس ، ارزیابی شد. برای تهیه کشت تازه قارچ‌های پاتوژن در محیط کشت سابرو دکستروز آگار تلقیح شد و در دمای 37 درجه به مدت 24 ساعت گرماگذاری شد تا قارچ به فاز رشد برسد. دیسک‌های کاغذی استریل (قطر mm 6، پادتن، ایران) آغشته به عصاره خام روی سطح محیط کشت سابرو دکستروز آگار(Merk) پوشیده شده با یک لایه نازک قارچی، قرار داده شد. از دیسک حاوی آنتی بیوتیک نیستاتین به عنوان کنترل مثبت و اتیل استات به عنوان کنترل منفی استفاده شد. پلیت‌ها در دمای 28 درجه به مدت 48 ساعت برای قارچ‌ها و به مدت 24 ساعت برای مخمر‌ها، گرماگذاری شد. سپس هاله‌ی عدم رشد (بر حسب میلی متر) اندازه‌گیری و ثبت شد.
2-11-3-فعالیت سینرژیسمی عصاره خام اکتینومیست‌ها با آنتی بیوتیک
برای بررسی اثر سینرژیسمی متابولیت‌های تولید شده توسط سویه‌های فعال با آنتی بیوتیک تتراسیکلین از روش دیسک دیفیوژن استفاده شد. دیسک حاوی 30 میکروگرم آنتی بیوتیک تتراسایکلین (قطر mm 6، پادتن، ایران) به 40 میکرولیتر از عصاره خام و دیسک تتراسایکلین آغشته به 40 میکرولیتر عصاره خام به طور مجزا در سطح محیط کشت مولر هینتون آگار کشت داده شده با سویه‌های پاتوژن اشریشیا کولی PTCC 1533 و سودوموناس آئروجینوزا قرار داده شد. پلیت‌ها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه گرمخانه‌گذاری شدند. فعالیت ضدباکتریایی تتراسایکلین، عصاره خام و نیز سینرژیسمی عصاره خام سویه‌های فعال بر حسب میلی‌متر ثبت شد.
2-11-4- فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین
حساسیت استافیلوکوکوس‌ اورئوس نسبت به عصاره خام سویه‌های فعال از روش دیسک دیفیوژن بررسی شد. سوسپانسیون میکروبی سویه‌های استافیلوکوک معادل نیم مک فارلند تهیه شد و به کمک سوآپ استریل بر سطح محیط کشت مولر هینتون آگار تلقیح شد. دیسک‌های استریل حاوی عصاره خام سویه‌های فعال با فاصله معین بر سطح پلیت قرار داده شد. پلیت‌ها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه گرماگذاری شدند. هاله عدم رشد بر حسب میلی‌متر اندازه گیری شد. همچنین از دیسک حاوی 30 میکروگرم وانکومایسین به عنوان کنترل استفاده شد. برای حصول اطمینان از این آزمایش برای هر سویه باکتری سه بار تکرار گردید و میانگین قطر هاله عدم رشد به عنوان قطر نهایی ثبت شد (2007 ,Dadgar).
2-12-بررسی فعالیت اگزوآنزیمی سویه‌های فعال