دانلود پایان نامه با موضوع استان مازندران و برنامه‌ریزی

دانلود پایان نامه

KF454858.1
KF454851.1 Streptomyces rochei strain MCCB 223


Streptomyces enissocaesilis strain MCCB 216
KF595309 Streptomyces sp. MN41

شکل 3-17. . دندوگرام توالی ژن 16S rDNA جدایه‌های فعال که به جنس استرپتومایسس قرابت نشان داد. اعداد ذکر شده در محل انشعاب نشانگر درصد نمونه‌گیری bootstrap از 1000 نمونه است.
فصل چهارم
بحث و پیشنهادات
4- بحث و پیشنهادات
بررسی‌های اخیر حاکی از آن است که سیستم‌های ژنتیکی در میکروارگانیسم‌ها قادر به برنامه‌ریزی برای مقابله با عوامل تهدید کننده حیات آن‌ها، می‌باشد. بر این اساس گونه‌های مقاوم میکروبی در حال ایجاد و گسترش‌اند. این موضوع می‌تواند بشر را در آستانه ورود به یک فاجعه پزشکی قرار دهد و چه بسا یک عفونت کوچک، به دلیل نبودن داروهای موثر تبدیل به بیماری مرگبار شود. از طرفی هنوز تعدادی از بیماری‌های باکتریایی، قارچی، ویروسی و انگلی وجود دارد که داروی موثر علیه آن‌ها شناخته نشده است. از این رو حتی در آغاز قرن 21، با آن‌که عصر طلایی آنتی‌بیوتیک‌ها سپری شده است، هنوز متابولیت ثانویه میکروارگانیسم‌ها می‌تواند برای تولید آنتی‌بیوتیک‌های جدید زمینه مناسبی برای تحقیقات کاربردی به ‌شمار آید (2011 Abdi Soofiani,).
بر اساس مطالعات اکتینومیست‌ها بزرگترین گروه تولید کننده ترکیبات ضد باکتریایی و ضد قارچی می‌باشند. این مسئله زمانی اهمیت پیدا می‌کند که بدانیم باکتری‌های بیماریزا با گذشت زمان نسبت به آنتی بیوتیک‌های موجود از خود مقاومت نشان می‌دهند (1991 ,Henkel ؛1993 ,Takizawa). این موضوع باعث می‌شود این بیماری‌ها از حیطه درمان خارج شوند. جهت فائق آمدن بر این مقاومت نیاز به آنتی بیوتیک‌های جدید است که تنها ابزار و منبع موجود برای تولید آنتی‌بیوتیک‌های جدید میکروارگانیسم‌ها بویژه اکتینومیست‌ها می‌باشند. اکتینومیست‌ها تقریبا 10 درصد جمعیت باکتری‌های رسوبات بستر دریا را تشکیل می‌دهند. ثابت شده که میکروارگانیسم‌های زیستگاهای دریایی به عنوان منابع شگفت انگیز تولید مواد بیواکتیو قوی بشمار می‌روند. در مورد اکتینومیست‌های دریایی گزارش کمی در دسترس است (2010 ,Das).
در سال‌های اخیر مطالعات در زمینه جداسازی و شناسایی اکتینومیست‌ها از مناطق مختلف ایران گزارش شده است. در مطالعات قبلی، اغلب سویه‌های اکتینومیست از خاک‌های مناطق مختلف جدا شدند. بررسی این منابع و داده‌ها نشان می‌دهد تا کنون مطالعه روی رسوبات دریا برای جداسازی اکتینومیست‌های دریایی در دریای مازندران صورت نگرفته است. لذا با توجه به اهمیت اکتینومیست‌ها در زمینه تولید آنتی بیوتیک، مطالعه حاضر با هدف جداسازی و شناسایی اکتینومیست‌های دریایی تولید کننده آنتی‌بیوتیک در دریای مازندران می‌باشد. در این پژوهش برای اولین‌ بار فعالیت ضدباکتریایی و ضد قارچی اکتینومیست‌های فعال بومی ده از رسوبات بستر دریا، مازندران مطالعه شد.
در این تحقیق جداسازی، غربالگری سویه‌های فعال، استخراج متابولیت‌ها، غربالگری ثانویه، تست عصاره خام روی سویه‌ مقاوم به آنتی بیوتیک، شناسایی مورفولوژیکی کلنی‌های اکتینومیست، توالی یابی آن‌ها بر اساس ژن 16S rDNA و رسم درخت فیلوژنی انجام شد.
4-1- جداسازی اکتینومیست‌های دریایی
به منظور جداسازی اکتینومیست‌های دریایی نمونه‌های رسوبات بستر دریای مازندران از شهرستان بابلسر در استان مازندران انتخاب شد و نمونه برداری تحت شرایط استریل انجام گرفت. برای جداسازی اکتینومیست‌ها، مطابق روش تاکیزاوا 1993 و داس 2011 از محیط کشت اختصاصی اکتینومیست‌ها به نام‌های SCA و ISP2 استفاده شد (2010; Takizawa, 1993 ,Das). کلنی‌های اکتیومیست پس از دوهفته نمایان شد. از بین رسوبات اعماق مختلف دریا، تعداد 80 جدایه اکتینومیست به صورت کلنی‌های پودری و خشک، که ویژگی اصلی کلنی اکتینومیست‌ها است در سطح آگار جداسازی و خالص سازی شدند. . والی در سال 2012 از رسوبات دریایی، سویه‌هایی از اکتینومیست‌ها جداسازی کردند که از میان آن‌ها، دو سویه بهترین فعالیت ضد میکروبی را داشتند. آن‌ها پیشنهاد کردند که اکتینومیست‌ها می‌توانند به عنوان منبع آنتی بیوتیک‌های جدید، معرفی شوند (2012 Valli,). مطالعات ما نشان داد که رسوبات دریای مازندران غنی از اکتینومیست‌های دریایی بوده و دارای پتانسیل بالایی در زمینه جمعیت اکتینومیست‌های دریایی می‌باشد.
4-2- غربالگری سویه‌های اکتینومیست فعال
غربالگری اولیه اکتینومیست‌های دارای فعالیت ضد میکروبی، از روش Cross Streak استفاده شد (Das, 2011) که یک روش بسیار مناسب برای بررسی فعالیت آنتاگونیستی بین میکروارگانیسم‌ها است. در این روش هر اکتینومیست در مرکز پلیت نوترین آگار به صورت یک خط مستقیم کشت داده شد. سپس سویه‌های بیماریزا به صورت یک خط عمود بر خط اصلی کشت اکتینومیست، تلقیح شده جدایه‌های اکتینومیست متابولیت‌های فعال تولید کرده و در به محیط کشت منتشر شد و مانع رشد سویه‌های پاتوژن شد. هاله‌ی عدم رشد اندازه گیری شد و بهترین سویه‌های فعال اکتینومیست، برای مرحله بعد انتخاب شدند. در پژوهش‌های انجام شده توسط والی در سال 2012 و هایاکاوا در سال 1988 نیز از این روش جهت گزینش سویه‌های فعال استفاده شد (Valli, 2012; Hayakawa, 1988).
4-3- استخراج متابولیت‌ها
جهت انجام مراحل بعدی کار نیاز به جداسازی متابولیت‌های فعال تولید شده توسط 7 سویه منتخب بود. با توجه به اینکه آنتی بیوتیک‌ها ساختار آلی دارند و در حلال‌های آلی قابلیت حل‌شدن دارند از بین حلال‌های مختلف حلال آلی اتیل‌استات استفاده شد. دهاناسکاران و همکاران در سال 2005 اکتینومیست‌های خاک‌های مناطق مختلف هندوستان را مطالعه کردند. برای غربالگری ثانویه جهت استخراج متابولیت‌های فغال ضدمیکروبی از محیط کشت مایع، از حلال‌های اتیل استات، متانول، کلروفورم و پریدین استفاده کردند و نشان دادند که اتیل استات بهترین حلال برای استخراج این مواد است (Dhanasekaran, 2005). نتایج فعالیت خوب عصاره خام استخراج شده با حلال آلی اتیل استات نشان دهنده تأیید این موضوع است.
4-4-غربالگری ثانویه عصاره خام جدایه‌های فعال
روش انتخابی ما در غربالگری ثانویه روش دیسک‌گذاری بود، این آزمایش روش معمول در تشخیص فعالیت ضدمیکروبی سویه‌هایی است که فعالیت مشخصی ندارند در این روش دیسک‌های کاغذی 6 میلی متری استریل حاوی عصاره خام روی سطح محیطی که با لایه نازک از باکتری ‌و یا قارچ‌های پاتوژن پوشیده شده بود قرار گرفت و هاله عدم رشد اندازه‌گیری شد. در این روش بایستی نکاتی را مورد توجه قرار گیرد تا نتایج کاملی بدست آورد از جمله دما، pH، غلظت نمک و غلظت آگار. pH از آن جهت مهم است که بعضی مواد ضد باکتریایی در محیط اسیدی موثر هستند و برعکس، بعضی مواد از جمله آمینوگلوزید‌ها در محیط‌های قلیایی اثر خوبی دارند. با توجه به اینکه محیط کشت ژله مانند بوده و دارای منافذ ریزی است که مواد ضد باکتریایی در محیط منتشر می‌شوند هر چه وزن مولکولی مواد منتشر شده در دیسک پایین تر باشد به همان نسبت به فاصله دورتری منتقل شده و قطر هاله عدم رشد بزرگتر می‌شود (2004 ,Salami).
اگر چه قطر هاله به تنهایی تعین کننده قدرت اثر ماده ضد باکتریایی استخراج شده و یا حساسیت باکتری مورد آزمایش نیست، اما با توجه به داده‌های جدول 3-3 مشاهده می‌شود که باکتری‌های استافیلوکوکوس اورئوس و باسیلوس سوبتیلیس بیش از دیگر میکروارگانیسم‌های پاتوژن محدودیت رشد داشته‌اند که این مطلب یافته‌های شیرر و همکاران را در سال 1971 تایید می‌کند که باکتری‌های گرم مثبت در مقابل متابولیت‌های تولید شده توسط استرپتومایسس‌ها حساسیت بیشتری دارند که دلیل آن عدم وجود لیپید‌ها زیاد در دیواره سلولی این باکتری‌ها است (Pandey, 2004). با توجه به هاله عدم رشد سویه‌های فعال می‌توان به این نکته اشاره کرد که نوع متابولیت تولید شده توسط این سویه‌ها متفاوت است. تنوع آنتی‌بیوتیک‌های موجود می‌تواند نشانگر این باشد که رسوبات دریای مازندران می‌تواند غنی از اکتینومیست‌های فعال با متابولیت‌های جدید باشد که نیاز به پژوهش بیشتر در این زمینه دارد.